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Figura 6: Il dominio ssei - come di PaTox deamidates proteine Gα eterotrimeriche. Da una tossina batterica catalizzare tirosina glicosilazione di Rho e deamidation di G e G q i proteine (A) micrografie fluorescenza delle cellule HeLa trattate con PaTox G (NxN) - D (glycosyltransferase inattivo e deamidase attivo) o PaTox G (NxN) - D (CS) (glucosiltransferasi inattivo e deamidase inattivo) e PA come un sistema di consegna dopo cella fame. Rho-attivando CNF e PA da soli sono controlli. Actina e nuclei sono stati colorati con TRITC-falloidina e DAPI. rispettivamente. barra della scala, 10 micron. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (B) RhoA attivazione da parte PaTox. Western Blot di RhoA precipitazione con GST - Rhotekin a tendina sulle cellule HeLa trattate con le proteine indicati con o senza PA. RhoA totale. GST - Rhotekin e GAPDH stanno caricando i controlli. I dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. Macchie non tagliate sono mostrati in figura 7c supplementare. (C) Analisi Western Blot di deamidation tossina-indotta delle proteine eterotrimeriche Gα in cellule HeLa trattate con le proteine indicate, utilizzando l'anticorpo monoclonale deamidation-specifici anti-Gα QE (3G3). Immunoblot di q Gα totale e GAPDH sono controlli di input. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. Macchie non tagliate sono mostrati in figura supplementare 7d. (D) l'analisi MS / MS di PaTox - catalyzed deamidation di Gα i2 a Q205. MS / MS del peptide trittico 199-MFDVGGQR-206 (in alto) e la sua forma deamidato 199-MFDVGGER-206 (in basso) di Gα i2 osservata a m / z 455,214 (2+) e m / z 455,709 (2+) . rispettivamente. dati aggiuntivi affiliazioni Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Friburgo, Germania. Thomas Jank, Kira E Böhmer, Marcus Steinemann, Joachim H C Orth & amp; Klaus Aktories Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Friburgo, Germania. Zentrum für Biosystemanalyse, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Friburgo, Germania. Institut für Biophysik und Physikalische Biochemie, Universität Regensburg, Regensburg, Germania. Institut für Biologie II, Fakultät für Biologie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Friburgo, Germania. Centre for Biological Studies Segnalazione (BIOS), Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Friburgo, Germania. contributi T. J. progettato lo studio, effettuato esperimenti, ha analizzato i dati e ha scritto il giornale; K. A. progettato lo studio, ha analizzato i dati e ha scritto il giornale; K. E.B. e M. Steinemann dati raccolti; J. H.C. O. progettato lo studio; E. H. e B. W. eseguito analisi MS; X. B. C. W. e C. H. eseguito analisi a raggi X; M. Spoerner e H. R.K. eseguito analisi NMR; e tutti gli autori hanno discusso i risultati e commentato il manoscritto. Competere interessi finanziari Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti. autore Corrispondente Figura 1 supplementare: similarità di sequenza di PaTox con glicosiltransferasi e deamidases, zucchero-donatore specificità di substrato e l'attività enzimatica di PaTox glycosyltransferase. Passa il mouse sopra la figura per ingrandire (A) allineamento sequenza aminoacidica della regione circostante la DxD-motif (marcato) di P. asymbiotica PaTox (numero di accesso C7BKP9) con diverse glicosiltransferasi: Tossina B (C. difficile numero tossina B. adesione P18177), la tossina letale (C . sordellii tossina letale. numero di accesso Q46342), α-tossina (C. Novyi alfa tossina. adesione numero Q46149), Lgt1 (Legionella pneumophila glucosiltransferasi 1. adesione numero Q5ZVS2). (B) Amino allineamento sequenza di acido di una regione di dominio del ssei - come di PaTox con Salmonella enterica fattore di virulenza ssei (SrfH) (numero di accesso Q8ZQ79), e la tossina Pasteurella multocida (PMT. Numero di accessione P17452). Il catalizzatore Cys-His-Asp triade di proteasi e deamidases papaina-come è evidenziato. Gli allineamenti sono stati preparati utilizzando residui identici Clustal W. sono inscatolati e mostrati in residui rossi, simili sono mostrati in blu. I numeri di accesso di sequenze di amminoacidi sono stati ottenuti da UniProt. (C) in vitro glicoidrolasi attività di PaTox per valutare lo zucchero donatore specificità. PaTox G - catalyzed idrolisi dei radiomarcati UDP-zuccheri indicati è stato analizzato mediante cromatografia su strato sottile e autoradiografia. I dati sono mezzi ± S. D. di tre esperimenti indipendenti. (D) La mutazione del motivo DxD abroga l'attività glycosyltransferase. Autoradiogram e Coomassie colorazione delle reazioni in vitro di glicosilazione con PaTox G e il mutante PaTox G (NxN) in combinazione con ricombinante RhoA e Rac1. Figura integrativa 2: MS analisi di tirosina GlcNAcylation di RhoA. Rac1. e Cdc42 da PaTox e glicosilazione durante l'infezione asymbiotica P.. Passa il mouse sopra la figura per ingrandire (A-C) cromatogrammi estratti ioni di LC-MS analisi dei modificato (pannello superiore) e GTPases wild-type (pannello inferiore) digerito con termolisina. I peptidi indicati di tipo selvaggio RhoA (a), Rac1 (b), e Cdc42 (c) sono stati in parte spostati da 203.1 Da indicando una modifica da parte N - acetilesosamina (HexNAc). Cromatogrammi sono stati sottoposti a scansione non modificato (traccia blu) e peptidi modificati (traccia rossa). Le forme HexNAc modificati dei peptidi sono stati rilevati esclusivamente in PaTox GTPases - treated. (D) MS-MS spettri del GlcNAc - Modified peptidi 27-AFPGEYIPTVFDNYSAN-43 e 20-LISYTTNKFPSEYVPT-35 di PaTox - Modified Rac1 e Cdc42. rispettivamente. ioni frammento sequenza-specifica sono annotati in blu (ioni di tipo B) e verde (ioni y-tipo). In tutte le GTPasi studiato qui, l'interruttore conservato ho residuo Y32 è stato identificato come l'acido accettore amino per GlcNAc. m / z. mass-to-carica. (E) glicosilazione di Rho in cellule di insetto Sf9 è stata valutata dopo l'infezione da P. asymbiotica e P. luminescens (molteplicità di infezione di 10) per 14 h. Le cellule non infette erano controlli. Dopo ampia lavaggio, le cellule sono state lisate e GlcNAcylation è stato analizzato da una reazione glicosilazione consecutivo con UDP [14 C] GlcNAc e PaTox G (pannello superiore) e immunoblotting con un anticorpo anti-Rac1 (Mab102), che riconosce solo non glicosilata Rac1 ( secondo pannello). L'infezione di cellule Sf9 di P. asymbiotica ma non da P. luminescens. che non presenta il - Gene PaTox, portato ad un segnale che indica un ridotto GlcNAcylation un'infezione mediata dell'interruttore I tirosina; anti-Rac1 (23A8) illustra il contenuto totale Rac1 (terzo pannello); anticorpo anti-GAPDH è stato utilizzato come controllo del carico (pannello inferiore). (F) La prova che anti-Rac1 (Mab102) non riconosce la proteina Rac glicosilata. macrofagi J774 sono stati trattati con PaTox G (100 ng / ml) e l'antrace antigene protettivo (PA. 700 ng / ml), solo PA e C. difficile tossina B (100 ng / ml) per 14 h. Le cellule sono state lavate, lisate e sottoposte a glicosilazione in vitro con PaTox G interpretato in (e) (pannello superiore). Western blot sono state decorate con anti-Rac1 (Mab 102) (secondo pannello), anti-Rac1 (23A8) (terzo pannello), e anti-GAPDH (pannello in basso) di anticorpi. I dati in (e) e (f) sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. Figura supplementare 3: Descrizione degli elementi secondari-strutturali di PaTox G e residui di aminoacidi importanti. Passa il mouse sopra la figura per ingrandire (A) Sequenza di P. asymbiotica PaTox G e l'assegnazione degli elementi strutturali secondari. Gli aminoacidi analizzati da mutagenesi sito-diretta sono contrassegnati da una freccia (Tabella supplementare 1). (B) Diagramma topologia di PaTox G con elementi strutturali secondari (colorati come in Fig. 3). Il dominio catalitico presenta un tipico GT-A volte con nucleotide volte binding (blu) e accettore piega vincolante (rosso), che sono indicato anche come singoli domini. L'adiacente fascio 3-elica è indicato in giallo. I primi residui 17 N-terminale (monomero A; 18 residui di monomeri B), due regioni brevi (A: residui 2300-2306, B: 2302-2305; A: 2386-2393, B: 2384-2392) e il C - residui terminali (a: 2421-2448; B: 2420-2448) non vengono risolti nella struttura e suscettibili di essere disordinato e mostrati come linee tratteggiate. (C) gli effetti cellulari di PaTox G - mutants con residui di nucleo catalitici scambiati. Micrografie di cellule HeLa trattati per 4 h con PaTox G wild type e le indicate mutanti catalitici di base (ogni 11 nm) in combinazione con PA (0,5 mg / ml) come sistema di consegna. Con i mutanti PaTox G - D2260A e PaTox G - R2263A non sono stati osservati effetti cellulari. PA da solo non ha mostrato alcun effetto (controllo). barra della scala, 50 micron. L'esperimento è stato ripetuto quattro volte. Figura supplementare 4: conseguenze funzionali di tirosina GlcNAcylation delle proteine Rho. Passa il mouse sopra la figura per ingrandire (A. B) Posizione di Y34 in RhoA nella inattiva (PIL) e (GTPγS) attiva conformazione. Il confronto delle Costruzioni cristalline di inattivi RhoA · PIL (a. PPB 1FTN) e la costitutiva attiva da RhoA - G14V · GTPγS (b. PDB 1A2B). Y34 è segnato e mostrato in rosso interruttore I regione, (Swi) è mostrata in blu e l'interruttore II (swII) regione in verde, i nucleotidi sono mostrati come bastoni in nero. (C. D) GlcNAcylation della Y34 non altera vincolante per RhoA nucleotide. analisi fluorimetrica di Mant-PIL (c) o Mant-GppNHp (d) legame al wild type RhoA (circoli chiusi) o glicosilata RhoA (cerchi aperti) legato al PIL. scambio nucleotide è stata monitorata dalla aumento della fluorescenza su Mant-PIL o Mant-GppNHp legame RhoA. Le curve sono stati montati da una singola funzione esponenziale (linee). Le barre di errore sono S. D. ± da tre repliche tecnici. (E. F), tirosina GlcNAcylation di RhoA impedisce PDZ-e lo scambio di nucleotidi LBC-stimolata. analisi fluorimetrica di scambio Mant-PIL con wild type RhoA (cerchi) e GlcNAcylated RhoA (triangoli). Dopo 5 minuti, guanina fattore di scambio nucleotide PDZ-RhoGEF (e) e p47-LBC (f) è stato aggiunto (segni aperti). I dati in (e) e (f) sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. (G) tirosina GlcNAcylation di RhoA. Rac1 e Cdc42 compromette l'interazione effettore in un sistema libero delle cellule. Western blot di esperimenti a tendina GST-effettrici con ricombinante RhoA. Rac1 e Cdc42 preglycosylated con PaTox G o il frammento catalitica di C. difficile tossina B con UDP-GlcNAc e UDP-glucosio. rispettivamente. Prima di co-precipitazione con gli effettori GST - Rhotekin (RhoA) e GST - PAK (Rac1. Cdc42), GTPasi sono stati caricati con GTPγS o GDPβS. (H. I) RhoA nella conformazione attiva è il substrato preferito per GlcNAcylation da PaTox. (H) autoradiogram e Coomassie colorazione in vitro 14 C-GlcNAcylation di RhoA precaricato con GTPγS o GDPβS di PaTox G (pannelli superiori). Il dominio catalitico di C. difficile tossina B (pannelli in basso), che utilizza il PIL - conformation inattiva di RhoA per la glucosilazione di T37, è stato utilizzato come controllo con UDP [14C] glucosio. (I) Esempi di glicosilazione dipendente dal tempo di 2.5 mM RhoA - GppNHp (cerchi pieni) e RhoA - GDP (cerchi aperti) di 0,5 nM PaTox G in presenza di 50 pM radiomarcato UDP [14 C] GlcNAc a 30 ° C . La quantificazione del modificato RhoA è stato fatto dopo la separazione con SDS-PAGE per autoradiografia. I dati sono stati montati su un singolo aumento esponenziale (linee tratteggiate) e le velocità iniziali di GlcNAcylation stati determinati dalla pendenza calcolata (linee rette) all'inizio delle reazioni. Per questa concentrazione di RhoA i valori erano 3,28 ± 0,08 mmol (prodotto) / [mg (enzima) · min] per la forma GppNHp e 0.32 ± 0.10 mmol (prodotto) / [mg (enzima) · min] per la forma del PIL. I dati sono mezzi ± S. D. di tre repliche biologiche. Figura supplementare 5: specificità di substrato di PaTox per quanto riguarda le proteine eterotrimeriche Gα e assorbimento cellulare. Passa il mouse sopra la figura per ingrandire (A) Western blot di deamidation in vitro delle proteine GST-Gα 100 nM PaTox G (NxN) - D per 1 ora a 30 ° C usando l'anticorpo specifico anti-deamidation Gα (QE). La quantità di totale GST-Gα stato rilevato da immunoblotting con un anticorpo anti-GST e servito come controllo di caricamento. (B) Actina colorazione PaTox G (NxN) - D o PaTox G (NxN) - D (CS) di topo trattato fibroblasti embrionali da wild type, Gα12 / 13- e topi / 11-deficienti Gαq. Le proteine sono state applicate in combinazione con PA per 8 h. barra della scala, 10 micron. (C) traslocazione di PaTox da endosomi precoci. Western Blot mostrando PaTox indotta deamidation delle proteine G eterotrimeriche in macrofagi murini (RAW 264.7 cellule) preincubata senza o con bafilomicina A1 (Baf. 100 nm) o brefeldina a (BFA. 100 nM) per 30 minuti. Le cellule sono state trattate con ricombinante lunghezza PaTox completo (300 pM) o il frammento PaTox G-D (1,4 nM) con o senza antigene protettivo (PA) come sistema di erogazione. Dopo 18 h di incubazione, le cellule sono state lavate e lisate. l'assorbimento della tossina e l'attività intracellulare è stato analizzato mediante Western blotting con anticorpi specifici per deamidation Gα QE. Anti Gα q e anti-GAPDH sono stati utilizzati come controlli di carico. Risultati in (a-c) sono stati ottenuti in tre esperimenti indipendenti. Figura supplementare 6: Immagini full-length che mostrano i marcatori peso molecolare per gel SDS-PAGE, immunoblot e autoradiografie inclusi nella Figura 2. Passa il mouse sopra la figura per ingrandire (A) la lunghezza completa radioimage di Fig. 2a. (B) Western blot non tagliate di Fig. 2a. (C) autoradiogrammi non tagliate di Fig. 2b. (D) Incensurate Coomassie macchiato gel SDS-PAGE di Fig. 2b. (E) radioimage Incensurate (pannello superiore) e Coomassie macchiato gel (pannello inferiore) di Fig. 2d. (F) radioimage Incensurate (pannello superiore) e Coomassie macchiati gel (pannello inferiore) di Fig. 2e. (G) radioimage Incensurate (pannello superiore) e Coomassie macchiato gel (pannello inferiore) di Fig. 2f. Vedere corrispondente legenda delle figure per i dettagli. Figura supplementare 7: Immagini full-length che mostrano i marcatori peso molecolare per immunoblot inclusi nelle figure 4 e 6. Passa il mouse sopra la figura per ingrandire (A) Integrale analisi Western blot delle macchie di Fig. 4c. etichettatura aspecifica di proteine per l'anticorpo anti-RhoA è segnato. (B) Integrale Western blot di Fig. 4e. etichettatura aspecifica di proteine mediante l'anticorpo anti-GST è marcato. (C) Western blot non tagliate di Fig. 6b. etichettatura non specifico delle proteine è segnato. (D) Western blot non tagliate di Fig. 6c. bande non specifiche sono contrassegnati. Vedere corrispondente legenda delle figure per i dettagli.
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